永乐五年（1407年）七月初四，徐皇后去世，年仅四十六岁。《明太宗实录》记载了这样感人的诀别一幕：徐皇后病危之际，朱棣前往探视，徐皇后嘱咐朱棣说：“当今天下虽说太平，不用兵甲，但民生并没有完全恢复，希望圣上多加体恤。”当朱棣问起皇后还有什么要说的时，徐皇后说：“在用人时，要广用贤才，明辨是非邪正，不要因为一个人有小过就弃之不用，也不要因为一个人有小聪明就委以重任，教导子孙以学业为重，对宗室以恩义相待。”并表示自己不能再报答朱棣的恩情，让他不要骄纵她的娘家人。朱棣听着，不禁泣不成声，徐皇后也泪流满面，在弥留之际还不忘劝朱棣以国为重，说自己生死有命，只希望他弃绝私恩、珍重自爱，别为自己过于伤心。

徐皇后临终之际，最大的遗憾是没有机会和朱棣再回一次北京，报赏当年靖难时随她一起守城的将校士民之妻，所以将这件事交代给皇太子朱高炽替她完成。永乐七年朱棣北巡，皇太子在南京监国，在车驾到达北京的第二天除赏赐北京官员军民之外，也对守城妇女给予赏赐，完成了徐皇后的遗愿。徐皇后还告诫皇太子朱高炽要“敬以事上，仁以抚下，肃以正家，恩以睦亲”，要他时刻记在心上。对于皇长孙朱瞻基，徐皇后也有教诲，让他专心致志、勤奋学习，并对朱棣说这个孙儿是远大之器，让他善加看待。徐皇后去世后，朱棣情难自抑，恸哭垂涕，群臣只能对他婉言劝慰。朱棣对群臣说皇后仁爱明察、贤能善良，将皇后比作东汉明德马皇后和唐代长孙皇后那样的贤后，并说皇后虽然身处宫中，但一心爱护百姓。想到皇后音容宛在，他痛惜道：“从此朕在宫中再也听不到皇后的直言了。”

朱棣悲痛之余，又对徐皇后追思甚笃，遂决定不复立皇后，也使得永乐一朝后位空缺长达十七年。朱棣又因徐皇后之丧白衣素服一年、辍视朝一年，日常只在西角门等地听政议事；皇太子诸王为母亲服斩衰三年之制，因徐皇后一直停灵未葬，皇太子在禫祭除服后又为母亲服素服即白衣冠絰带数月；群臣为皇后服斩衰二十七日、白衣素服一年，周年祭后群臣参朝时服浅淡色衣乌纱帽黑角带，退朝办事仍然素服，朔望朝见服公服朝服，一直到二周年过后禫祭礼毕才恢复正常。又在灵谷、天禧二寺为她举行大斋，接受群臣的祭祀，由光禄寺准备祭奠物品。十月十四日，朱棣为其上谥号曰仁孝皇后，据《金陵大报恩寺塔志》记载，朱棣曾下令在南京大报恩寺广集僧众，为仁孝皇后举行了长达百日的荐扬法事。

此外，朱棣还致书大宝法王分别于山西五台山、南京灵谷寺为仁孝皇后建斋追荐冥福，现存两份书信均为黄蜡纸本、描金龙纹、汉藏文，原藏大昭寺；命正一嗣教真人张宇初率诸道众为仁孝皇后举荐扬大斋祈福超度。徐皇后的突然去世对朱棣打击很大，他一度无法接受这样的事实，因而十分悲伤，在谥册中提到“岂意盛龄，遽焉倾逝，朕心恸悼，万姓尽伤。”由于朱棣的重视，徐皇后的丧礼规格在明清两代历史上都是极为隆重的。

永乐五年十一月十四日，冬至，以仁孝皇后丧免朝贺，朝鲜国王李芳远派遣陪臣朴山言奉仪物致祭仁孝皇后。

永乐六年八月二十日，浡泥国王麻那惹加那惹乃率其妃及弟妹男女并陪臣来朝，王妃所要进献给皇后的笺表为金缕文，并且有本地土产奉上。这时徐皇后已经过世，朱棣便命人将其所进献的笺表和土产陈列于灵前。

永乐七年正月二十一日，暹罗国王昭禄群膺哆罗谛剌派遣使臣柰使赖卒等奉仪物致祭仁孝皇后，朱棣命中官到灵前告知。

出于对徐皇后的深爱，朱棣从未在其生前册封过一位妃子，直至永乐七年二月，徐皇后去世逾年，朱棣才举行册封典礼，正式册封后宫诸嫔妃。

永乐七年二月（1409年），朱棣北巡，回到了盛满往事的北平，并着手迁都事宜，于是命礼部尚书赵羾和江西术士廖钧卿等前往北京一带卜选陵址，随即选得吉地于昌平县天寿山，同年动工营建陵寝。由于徐皇后一时无法入土为安，朱棣便将她的灵柩停放在南京皇宫中整整六年。

永乐十一年（1413年）二月长陵地下玄宫落成，朱棣命次子汉王朱高煦将母亲仁孝皇后的梓宫从南京护送至北京葬于长陵，同时下令巡狩北京，跟随亡妻的灵柩北上。徐皇后也是入葬明十三陵的第一人，此后朱棣频繁巡幸北京，动辄逗留数年。

永乐二十二年（1424年）七月十八日，壮志未酬的朱棣病逝于征讨漠北回师途中，享年六十五岁，临终之际除交代传位皇太子及身后丧礼等事，还留下遗嘱将来让仁孝皇后的神主与自己的梓宫合于一处祭祀。同年十二月，朱棣与徐皇后合葬长陵。

永乐二十二年（1424年）九月初一，仁宗朱高炽遵照朱棣临终时的遗嘱，将母亲仁孝皇后的神主与父亲朱棣的梓宫合于一处祭祀。也正是由于朱棣的遗嘱，使得他们成为明清两代唯一一对已经去世多年的皇后和刚刚去世的皇帝同一天、同地点、同礼仪上尊谥的帝后。九月初十，仁宗为朱棣上尊谥曰“启天弘道高明广运圣武神功纯仁至孝文皇帝”，庙号“太宗”；为仁孝皇后上尊谥曰“仁孝慈懿诚明庄献配天齐圣文皇后”。升祔太庙。